草鱼(Ctenopharyngodon idellus; 数量 = 320)接受四种不同的日粮，为期56天。实验日粮为：含10%鱼粉(不含菜籽粕)的鱼粉(FM)和含50%菜籽粕(不含鱼粉)的菜籽粕(RM)，以及两种半纯化日粮，不含(T0)或含1.25%(T1)的补充水解单宁。RM日粮中单宁的大致含量为1.31%，接近T1的含量，而FM的单宁含量接近T0的含量。RM组的草鱼增重率明显低于FM组，而T1组的采食转化率和采食率明显高于T0组。RM组的肌脂含量明显低于FM组，而T1组则明显低于T0组。T1组和RM组的肠道胰蛋白酶和α-淀粉酶活性明显高于其他治疗组。T1组和RM组的肝脏天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶的活性较其他治疗组低，而T1组和RM组的肝糖原、丙二醛的活性明显高于其他治疗组。在血清中，T1组和RM组的总蛋白和球蛋白含量均显著高于T1组和RM组，而RM组的白蛋白明显低于FM组。高通量测序结果显示，蛋白杆菌、肠杆菌和放线菌是各组间的主要细菌种类。T1组和RM组的肠道微生物多样性较高。冗余分析表明，单宁、菜籽粕和肠道胰蛋白酶活性与几种不同的肠道微生物群的相对丰度在门类和/或属水平上呈正负相关。结果表明，1.25%的单宁不能成为RM组草鱼生长不良的主要原因，但蛋白质代谢受到干扰，碳水化合物的吸收得到改善，脂质的积累减少。此外，单宁和菜籽粕的补充可以调节肠道微生物群，可能通过发酵饮食营养、产生消化酶、调节益生菌等方式有序地调节肠道功能。

介绍

高通量测序技术提高了对鱼类肠道微生物群落的洞察力，这些微生物群落对生长、营养、免疫力、维持正常肠道功能和抵抗入侵病原体的能力有重要影响(1，2)。然而，影响肠道微生物群落的因素很多，如宿主、发育阶段、环境和饮食等（3-5）。一些研究发现没有发现饮食影响（6，7），而其他研究则发现了明显的影响（5，8，9）。这种差异可能是由于细菌分类(自生或异生细菌)、肠道条件(宿主的摄食习惯、生理特征和停留时间)、所使用的分子方法和饮食的组成等因素造成的(5)。

一些研究发现了肠道微生物群与植物蛋白成分之间的关系，特别是对豆粕（SBM）的影响（10，11）。然而，关于菜籽粕和菜籽粕衍生的反营养因子(ANFs)对水产养殖物种肠道微生物群的影响的资料较少(12，13)。一项关于金头鲷(Sparus aurata)的研究报告称，用菜籽粕替代16%的鱼粉对胃和肠道微生物群没有明显影响(14)。

油菜籽粉是水产养殖中的重要饲料成分(15，16)。由于其高蛋白含量（32-45%，干物质）和相对平衡的氨基酸谱，用菜籽粉部分替代鱼粉的研究在一些远洋鱼种中进行了研究（17，18）。然而，当高含量的菜籽粉被替代时，发现了负面影响。Webster等人(19)报告说，48%的菜籽粉会损害海峡鲶鱼(Ictalurus punctatus)的生长性能。Bu等(20)报道，当用菜籽粉代替20%的鱼粉，在乌苏里鲶(Pseudobagrus ussuriensis)的日粮中，抗氧化能力和非特异性免疫力都受到损害。一些研究表明，营养不平衡、高纤维含量（132 g/kg干物质）和ANFs（如葡糖醇酸、植酸和单宁）会损害营养代谢，对器官健康产生负面影响，从而降低生长性能（21-24）。

单宁是油菜籽粕中重要的ANFs，是具有多种化学结构的次生化合物，可分为水解单宁和缩合单宁（25）。在体内，可水解单宁会降解为较小的化合物，并伤害肝脏和肾脏(26)，这在反刍动物、啮齿类动物和家禽等动物中进行了探索(27，28)。有趣的是，水解性单宁在猪、大鼠和牛中没有诱发不良反应(29，30)。从板栗中提取的可水解单宁在1.5-12.0 g/kg的膳食补充水平下，可水解单宁(饲料级单宁酸）对鸡的肠道健康有益，可控制梭状芽孢杆菌的扩散(27)。一种富含水解鞣酸的提取物在日粮补充水平为1-3%时可减少肠道滑肠菌的产生，优化公猪十二指肠粘膜形态(28)。虽然在体外接受了单宁酸通过结合蛋白质或其他矿物质影响消化，但不管是菜籽粕中含有的或补充的膳食水解性单宁酸，还是为了提高鱼的生长性能和健康，其对肠道微生物群的影响仍然不清楚。

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是一种典型的草食性鱼类，具有重要的中心经济意义，许多研究对草鱼的生长、免疫、营养和肠道凋亡进行了研究(31-33)。多项研究表明，草鱼日粮中油菜籽粕补充量不超过35.0%为宜(34-36)。对单宁的研究表明，印度大鲤鱼能耐受2%的食性水解单宁，而尼罗河罗非鱼能耐受0.5%的食性水解单宁(37，38)。本研究利用草鱼的肠道微生物群、生长性能和鱼类日粮的几个生化参数进行表征。实验日粮含有50%的菜籽粕或补充1.25%的水解单宁，目的是假设肠道微生物群和生物条件之间的相互作用模式，同时为杂食性和肉食性鱼类日粮中有效使用菜籽粕提供可能的建议。

材料及方法

实验鱼和环境条件

本实验在位于上海市浦东新区惠南镇滨海的上海海洋大学沿海养殖基地进行。草鱼(初重：8.18±0.81 g)从湖州南浔鸿浩水产公司购得草鱼(初重：8.18±0.81 g)。三百二十条鱼被随机分配到16个室内网箱中，每个网箱容积为2.5 m2，水深70～80 cm。每笼用20条鱼，随机分为4组，4个重复组（共320条鱼）。在1周的适应期内喂食商品饲料。

实验期间每天对环境和水质指标进行监测。笼子里接受过滤后的池水和不间断曝气，以保持适当的溶解氧(>5 mg/L)和铵态氮(<0.6 mg/L)水平。水温在24至32℃之间变化。

饮食与喂养

饲喂试验持续了56天，每天将所有鱼饲喂3次明显饱食（上午7:00，下午12:00和下午17:00）。喂食后30分钟收集未进食的饲料，然后干燥并称重以纠正饲料摄入。在试验期间，当食欲改变时调整喂食量。配制了四种等氮饲料（粗蛋白30.6–31.2％）和等能量饲料（总能量16.8–17.6 MJ / kg）。两种是实用饮食，另外两种是半纯饮食。实际饮食分为鱼粉组（FM）和菜籽粉组（RM），含有无菜籽粉蛋白源的FM（含10％鱼粉）和含有50％菜籽粉且不含鱼粉的RM（表1））。加入酪蛋白和明胶作为主要蛋白质来源，即半纯化的日粮T0（可水解单宁含量为0％）和T1（可水解单宁含量为1.25％）。RM饮食中单宁的近似百分比含量为1.31％，接近T1饮食中的含量。FM饮食中单宁的大概含量为0.16％，接近T0饮食的含量。将所有成分通过60目筛子磨成细粉，根据配方称重并与大豆油充分混合，然后加入水并用实验性饲料粉碎机制粒，在40°C的通风烤箱中干燥约12 h C。干燥后，将日粮破碎并筛成合适的颗粒大小（直径1.5毫米），并妥善保存在阴凉干燥，通风良好的地方。表1

表1。日粮的成分和营养水平（以风干计）％。

样品采集

在56天的喂食期结束时，对每个网箱中的所有鱼进行计数并称重。从每个笼子中随机取出7条鱼（每组28条鱼），用丁子香酚溶液（100 ppm）麻醉，并在解剖前通过对头盖骨的猛击杀死。将鱼的外表面擦干净，并在腹中线处打开腹部。测量体重和肠重量。从尾静脉收集血样，在4°C下以4000×g离心10分钟，将血清移至离心管中，并保存在-20°C下进行检测。收集整个肠，肝胰脏和肌肉，在冰上冷冻，然后保存在-20°C下。体重增加（WG），饲料转化率（FC比），饲喂速率（FR）和相对肠重量通过以下公式计算：

WG =（最终重量–初始重量）×100 /（初始重量）。

FCR =给定的饲料量/体重增加。

FR =总饲喂×100 / [饲喂期×（最终体重+初始体重）/ 2]。

存活率（％）=鱼的最终数量×100 /鱼的初始数量。

相对肠重量（％）=肠质量×100 /体重。

喂食期结束后，将三只鱼从组中随机取出（在最后一次喂食后5-6小时收集），如上所述进行麻醉和杀死。无菌除去整个肠道，并通过小心地挤压到无菌容器中收集消化样品（杂菌），并在DNA提取之前在-80°C下保存。

所有程序均根据有关实验动物的护理和使用的国家和机构法规进行。根据上海海洋大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的规定进行了实验鱼的实验处理和处理，该研究得到了上海SHOU的IACUC的批准。

肌肉成分分析

将肌肉在70°C干燥2小时，然后在105°C恒重以确定水分。通过凯氏定氮法测定氮（N×6.25）来测定蛋白质。通过使用氯仿-甲醇萃取的醚萃取法提取脂质，并在550°C的燃烧条件下干燥物质（39）。

参数和消化酶活性

通过添加无菌的0.85％盐水溶液将肝胰脏和肠样品匀浆以制备10％（W：V）匀浆，然后在4°C下以4000x g离心10分钟。上清液在12小时内用于消化和免疫酶活性分析。

在肝胰腺中，使用特定的分析程序和市售试剂盒（建城生物工程研究所，南京）测量丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的活性，丙二醛（MDA）的含量和肝糖原的含量。使用特定的分析程序和市售试剂盒（建城生物工程研究所，南京）测量血清参数（总蛋白，白蛋白和尿素氮）。

按照Natalia等人的方法分析胰蛋白酶的肠活性。（40）。根据Worthington（41）测量α-淀粉酶的活性。脂肪酶的活性是基于对在橄榄油（的稳定的乳液，由于释放到甘油三酯酶促水解脂肪酸测量测定42使用特定的分析方法和市售的试剂盒（建成生物工程研究所，中国南京））。所有酶测定均一式四份进行。

肠道菌群分析

DNA提取

从200 mg的每种消化物样品中提取DNA。根据制造商的说明，使用用于土壤的FastDNA Spin Kit（MP Biologicals，Solon，OH，USA）进行DNA提取。使用NanoDrop ^TM  1,000分光光度计（Thermo Scientific，DE，美国）测定DNA浓度。

PCR扩增

为了分析细菌群落，进行了16S rRNA基因的可变区V3-V4的扩增。使用细菌通用引物338F（5’ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG 3’）和806R（5’GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT 3’）进行PCR。PCR反应基于Xiong等。（43）。从2％的琼脂糖凝胶中提取所得的PCR产物，并使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（Axygen Biosciences，美国加利福尼亚州联合市）进一步纯化，并根据制造商的方案使用QuantiFluor™-ST（美国Promega）进行定量。

高通量测序

根据Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd.（中国上海）的标准规程，将纯化的扩增子等摩尔合并，并在Illumina MiSeq平台（Illumina，圣地亚哥，美国）上进行配对末端测序（2×300）。原始的fastq文件由Trimmomatic进行质量过滤，并由FLASH合并，并符合以下标准：（i）在50 bp滑动窗口上平均质量得分<20的任何站点上，读取均被截断。（ii）重叠长度大于10 bp的序列根据其重叠而错配不超过2 bp。（iii）根据条形码（完全匹配）和引物（允许2个核苷酸错配）分离每个样品的序列，并去除含有歧义碱基的读数。

细菌16S rRNA V3-V4区域的文库构建和测序由Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd.（中国上海）进行。

数据分析

除肠道菌群以外的数据以平均值±标准差表示，并通过SPSS 17.0版中的单向方差分析（ANOVA）进行分析。当方差分析确定组之间的差异时，通过Duncan多范围检验分析平均值的差异。显着性水平设置为  P  <0.05。

在Majorbio I-Sanger Cloud平台的免费在线平台（https://www.i-sanger.com/）上分析了肠道菌群的数据。使用UPARSE（版本7.1）和可同时执行嵌合体过滤和OTU聚类的新型“贪心”算法，将操作分类单元（OTU）聚类，其相似性截止值为97％。使用RDP分类器算法（http://rdp.cme.msu.edu/）针对席尔瓦（SSU123）16S rRNA数据库，使用70％的置信度阈值。OTU采摘不包括嵌合体和碱基不明确（N）的标签。相应的稀疏曲线和热图数据是使用R项目（v3.0.3）软件生成的。使用OTU，Chao，Ace（基于丰度的覆盖率估算器），Shannon和Simpson指数将Alpha多样性用于分析样本之间物种多样性的复杂性。根据系统发育信息，使用快速UniFrac度量矩阵的主成分分析（PCA）来比较微生物区系（44）。使用Kruskal–Wallis秩和检验分别比较FM和RM组以及T0和T1组。当P  <0.05 时，差异被认为是显着的  。

结果

生存与成长表现

FM和T1的存活率高于其他治疗（P  = 0.494），而相对肠重量却呈现相反的趋势（P  = 0.682）。但是，FM组的体重增加率显着（P  = 0.000）高于RM组，在T0和T1组中最低（表2）。 与T0组相比，T1组的FC比和摄食率显着更高（P = 0.000）。体重增加率，FC比和饲喂率随单宁含量的变化而变化，并且在实际饲料和半纯化饲料之间遵循相同的趋势。表2

表2。草鱼的存活和生长性能（平均值±标准偏差，  n  = 4）。

肌肉成分

RM和T1的肌肉水分含量高于其他处理（P  = 0.430，  表2）。FM组的肌肉灰分显着 低于其他组（P = 0.002）。FM和RM组的蛋白质含量显着（P  = 0.000）高于T0和T1组。FM和T0组高于RM和T1组。FM和T0组的脂质含量显着 高于其他治疗组（P = 0.000）。

消化酶活性

 与其他治疗组相比，FM和T0组的胰蛋白酶和α-淀粉酶活性显着降低（P = 0.000）（表2）。 与RM组相比，FM组的脂肪酶活性显着高（P = 0.000），而在T0和T1组最低。

肝胰腺和血清生化参数

 与其他治疗相比，在T0组和FM组中，肝胰腺中MDA和糖原的含量显着降低（P = 0.000）（P  = 0.011）。 与其他组相比，T0组AST的活性显着更高（P = 0.005）（表2）。血清参数显示， 与其他处理相比，T1和RM组的总蛋白（P  = 0.000）和球蛋白（P = 0.000）显着较高，而T1和RM组的尿素氮较低。 FM组白蛋白显着高于P组（P = 0.000）。

高通量序列数据的特征和Alpha分集结果

从研究隔室的12个样品中分配的操作分类单位（OTU）总数为2,067，显示97％的序列同一性。反射曲线（图S1）显示样品达到饱和相，表明足够的测序深度。

草鱼的异体肠道菌群的α多样性  如图1所示。丰富度估计值由sobs，ace和chao指数提供支持，这些指数指的是一个社区中细菌物种的数量，而没有考虑每种物种的丰度。多样性指数得到香农指数和辛普森指数的支持，并受到物种丰富度和物种均匀度的影响。RM中的Sob高于T1（P  = 0.046）。RM中的Chao高于T1（P  = 0.048）。RM中的Ace高于FM（P  = 0.454）。RM和T1组的Shannon指数高于其他治疗组（P  = 0.490），而Simpson指数则相反（P  = 0.311）。一些指数表明没有显着差异，这可能归因于有限的样本，个体内部和群体内部的变异。

图1。草鱼肠道消化菌群的α多样性结果。通过α-多样性分析揭示了单个样品中微生物群落的丰富性和多样性，不同字母表示四组之间存在显着差异（P  <0.05）；没有字母的值表示无显着差异（P  > 0.05）。

肠道菌群的组成，丰度和差异

使用维恩图直观地显示常见/唯一OTU的数量；FM，RM，T0和T1组的平均门数分别为39、33、34和27（图2A，B）。FM，RM，T0和T1组的平均属数分别为606、549、572 和364（图2C，D）。

图2。维恩图显示隔室核心微生物群的OTU分布。 （A）  实际饮食组：在门类水平上，FM和RM组的32个OTU被确定为核心菌群。 （B）  半纯饮食组：在门级别，T0和T1组的25个OTU被确定为核心菌群（每个隔室中80％的样品）。 （C）  实际饮食组：FM和RM组的471个OTU被确定为核心微生物群（每个隔室中80％的样品）。 （D）  半纯化饮食组：在属水平上，T0和T1组的316个OTU被确定为核心菌群（每个隔室中80％的样品）。

在门级别，对每个组中相对丰度最高的门进行排名，并对其结构进行分析，并在图3中显示。 。其中包括变形杆菌（FM，61.73％; RM，43.4％; T0，47.31％; T1，43.99％），Firmicutes（FM，12.22％; RM，29.93％; T0，39.21％; T1，1.93％），放线菌（ FM，10.13％; RM，14.95％; T0，5.55％; T1，30.68％），拟杆菌（FM，3.18％; RM，2.15％; T0，4.19％; T1，0.24％），Chloroflexi（FM，4.93％ ; RM，3.70％; T0，0.42％; T1，14.88％），蓝细菌（FM，4.06％; RM，2.60％; T0，0.74％; T1，3.03％），糖杆菌（FM，0.75％; RM，0.34） ％; T0，0.1％; T1，2.11％），梭菌（FM，0.36％; RM，1.11％; T0，0.67％; T1，0.06％）。这些结果表明，草鱼异体肠微生物区系的优势菌群是变形杆菌，硬毛菌和放线菌。图3

图3。门水平的肠道细菌组成（相对OTU组成）。

主要的异源属显示在  图4中。该属  Oxalobacteraceae  （17.21％），  鲍曼不动杆菌  （12.97％），  Paraburkholderia  （7.03％），和  假单胞菌  （4.28％）显示，在FM组的食糜最高丰度。 在RM组中，unclassified_p_Firmicutes（19.03％），  Oxalobacteraceae  （7.39％），  Acinetobacter  （6.77％）和  Gemmobacter（3.03％）属显示最高丰度。在T0组的消化道中，葡萄球菌属   （26.45％），  草酸杆菌科  （13.02％），  不动杆菌属  （6.37％）和  旁囊​​菌属 （5.53％）显示出最高的丰度，而在T1中，属  Propionibacteriaceae  （17.06％），  Gemmobacter  （10.60％），JG30-KF-CM45（6.11％），和  Rhodobacteraceae  （5.44％）显示出最高的abundance.FIGURE 4

图4。在属水平上的肠道细菌组成（相对OTU组成）。

就门和属水平而言，不同组之间的异源微生物群的相对水平显示出以下结果：在门水平上，FM和RM之间没有显着差异（图5A），而放线菌，绿叶弯曲菌，糖细菌的相对丰度，扁平菌和WS6  在T1组显着高于P0组（图5B）（P <0.05 ）。在属水平上，丙酸杆菌属，芽孢杆菌属，红细菌菌属，JG30-KF-CM45，PeM15，  加州丁香科，黄单胞菌科，Tropicimonas和  Defluviimonas的相对丰度   显着（P <0.05），T1组高于T0组（图5D）。在RM组中，unclassified_p_Firmicutes  比FM组显着（P <0.05）高（图5C）。

图5。门和属水平的肠道细菌组成差异。不同组的数据显示为门（A，B）  和属  （C，D）的相对丰度（％  ）。（A）  在实际饮食组中门上的细菌组成差异。 （B）  纯化饮食组中门的细菌组成差异。 （C）  实际饮食组中属细菌组成的差异。 （D）  纯化饮食组中属细菌组成的差异。通过wilcoxon秩和检验进行统计学分析，“ *”表示有显着差异（P  <0.05）。

主成分分析（PCA）是一种分析和简化数据集的方法。PCA图上不同样品之间的距离越近，表明样品的微生物群组成越相似。第一和第二主成分的贡献率分别为27.1和14.8％（图6，  p = 0.181）。得分图中的所有样本均在95％的Hotelling T平方椭圆内，这表明在分析的样本中不存在异常值。T0组的大多数位于第一象限和第二象限，而T1则位于第一象限。FM组的样本与RM组部分重叠，这些样本分布在第三和第四象限。如图所示，T0和T1组之间的差异较大，而FM和RM组之间的差异较小。图6

图6。属水平上的主坐标分析（PCA）：PCA的散点图指示来自不同微生物群的指纹差异。第一主成分和第二主成分（PC1，X轴和PC2，Y轴）分别为27.1和14.8％，Q ²  = 0.0934。

在属水平上，分层聚类的热图分析（根据分布图）表明FM和RM组的消化菌群组成相似，而T0和T1不同（图7）。

图7。细菌水平在4组之间的分布。行表示属属的30种主要细菌，列表示4组。在图片的右下角，带有图例的颜色强度表示属水平细菌的平方根变换值。用邻接法标出细菌系统发育树，用布雷距离表示不同样品之间的关系。

微生物群落结构与饮食特性的关系

研究了膳食单宁，菜籽粕和几种生化因子等不同因素对消化微生物群系统组成的潜在影响。RDA指出了不同环境因素对肠道菌群系统发育组成的潜在影响。除去冗余变量后，为RDA选择了两个环境特征。如图8所示  ，单宁含量（P  = 0.003）和菜籽粕含量（P  = 0.014）显着影响微生物群落结构，并与肠道胰蛋白酶活性有关（P  = 0.015）。

图8。MiSeq数据（符号）和饮食特征（箭头）的冗余分析（RDA）（n  = 3）。不同组的数据显示门（A，B）  和属  （C，D）的 RDA  。（A）  门上的RDA，包括油菜籽和单宁。 （B）  门上的胰蛋白酶的RDA。 （C）  RDA属油菜籽和单宁酸。 （D） 胰蛋白酶属的RDA。绿色箭头表示肠道菌群，红色箭头表示饮食特性和一些生化指标，红色箭头的长度表示对肠道菌群的影响；红色箭头表示对肠道菌群的影响。红色箭头和绿色箭头的角度表示相关性（锐角，正相关；钝角，负相关；直角，无相关）；从样本到红色箭头的投影，该距离表示饮食特性对样本的影响。

本研究表明，在菜籽水平上，单宁与放线菌和绿弯曲菌的相对丰度呈正相关，而与菌丝菌和变形杆菌的相对丰度呈负相关（图8A），在菜籽粕中未获得类似的关系（图8B）。 。油菜籽粉与肥大菌和变形杆菌的相对丰度呈正相关，与放线菌和绿弯曲菌的相对丰度呈负相关。在属水平上，单宁和菜籽粕均与PeM15，丙酸杆菌属和芽孢杆菌的相对丰度呈正相关  ，与PeM15，双歧杆菌和  双歧杆菌的相对丰度呈负相关。 不动杆菌，草杆菌科和  葡萄球菌  （图8C）。肠胰蛋白酶活性与Firmicutes，不动杆菌和Caldilineaceae正相关  ，而   与Gemmobacter，Propionibacteriaceae和  Staphylococcus负相关   （图8D）。

讨论区

单宁和菜籽粕对草鱼生长和异养肠道菌群的影响

在以前的研究中，将菜籽粕补充到水产养殖饮食中时观察到了负面影响。Webster等。（19）报道，当饮食中含有48％的菜籽粕时，channel鱼的生长会降低。据报道，乌苏里also鱼也有类似的结果，该结果表明，当用菜籽粕代替20％的日粮鱼粉时，比增长率降低（20）。在本研究中，RM组体重增加率降低，而T1组对生长性能没有负面影响。这表明膳食单宁不是50％菜籽粕降低草鱼生长性能的直接原因。

尽管增重速率在T1中不受影响，但FC比和进料速率均增加。这与关于印度主要鲤鱼的报道是一致的，印度主要鲤鱼可以忍受2％的日粮单宁酸，而对生长性能没有明显影响（37）。但是，在尼罗罗非鱼的日粮中添加2.5％的日粮可水解单宁时，体重增加率降低，FC比增加（38）。通常认为，单宁酸通过与饮食营养结合并形成不易消化的复合物来抑制吸收。鱼可能增加他们的饲料摄取量，以减轻营养不良，以及在T1高FC比率也证实了这一（25，  45）。

变形菌门和厚壁菌门是草鱼（的肠道微生物群的最普遍的和共同门类46，  47）。在本研究中，变形杆菌，硬毛和放线菌被鉴定为草鱼中主要的异源肠道菌群。这与用黑麦草饲喂草鱼的结果是一致的，黑麦草是草鱼养殖中广泛使用的饲料补充剂（46）。但是，单宁酸降低了变形杆菌和Firmicutes的相对丰度，而增加了放线菌的相对丰度。油菜籽粉降低了Proteobacteria的相对丰度，同时增加了Fimicutes和Actinobacteria的相对丰度。这表明生长性能，营养沉积和肠道菌群（尤其是硬毛菌）之间的关系。

单宁和菜籽粕对鲤鱼蛋白质代谢的影响

人们普遍认为，生长与养分的沉积有关，尤其是鱼中蛋白质的沉积（48）。许多研究表明，饮食菜籽粕影响蛋白质的代谢（20，  49）。在对军曹鱼（Rachycentron canadum）的研究中，当添加13％的菜籽粕时，肌肉蛋白含量，粗蛋白的表观消化系数，氮保持率和蛋白效率比降低（50）。虹鳟（Oncorhynchus mykiss）和杂交罗非鱼（Oreochromis niloticus  ×  Oreochromis aureus）的结果也相似。）当包括到他们的饮食，分别为（50％和28.5％菜籽粉51，  52）。在水生动物中，有关单宁对蛋白质代谢的影响的信息有限。Buyukcapar等。（38）表明，尼罗罗非鱼的肌肉蛋白质含量随着日粮中单宁含量的增加而降低。但是，Omnes等。（53）表明，欧洲鲈鱼中蛋白质的表观消化系数随日粮中单宁含量的增加而显着降低。在本研究中，FM和T0组的肌肉蛋白质含量高于其他治疗方法，表明50％的菜籽粕降低了蛋白质沉积，单宁的应用可能是一个重要原因。但是，要检验该假设，还需要进行其他研究。

据报道，单宁酸 通过与胰蛋白酶和饮食蛋白结合来抑制氨基酸的体外吸收  （54）。但是，在本研究中，与其他治疗相比，T1和RM组的胰蛋白酶活性明显更高。先前的研究表明，单宁酸通过与膳食蛋白质形成较不易消化的复合物而不是抑制消化酶来损害蛋白质的消化（25）。这是因为在饮食单宁暴露于消化酶之前，它们可能与唾液特有的单宁结合蛋白和饮食蛋白复合（55）。因此，为了增加蛋白质的消化能力，肝胰腺分泌更多的胰蛋白酶。尽管有这种补偿，人体仍可能缺乏氨基酸来合成新蛋白质，从而导致蛋白质沉积降低。T1期肝AST和ALT的低活性也证实了这一点。

在肝胰腺中，氨基转移酶将氨基酸分解代谢，然后被肠道吸收，并将氨基转移至α-酮酸（17）。如果面临可用氨基酸不足的情况，酮酸会减少，并且需要较低的AST和ALT活性（50）。在本研究中，与其他治疗相比，T1和RM组的肝AST和ALT活性明显降低。这表明蛋白质的生物合成下降，单宁酸和菜籽粕氨基酸不平衡导致的氨基酸不足可能很重要。在日本鲈鱼中发现了类似的结果（Lateolabrax japonicus）饮食中含10％的低芥酸菜籽粕。肝脏中ALT和AST的活性受到影响，干物质，蛋白质，脂质和磷的表观消化系数值降低（17）。除抗营养功能外，单宁还被认为对某些动物有毒（56）。在鲤鱼（Cyprinus carpio  L.）中注射单宁（10 mg / kg体重），表明对氧化应激诱导和抗氧化酶抑制具有毒性（57）。在大鼠中，单次皮下注射700 mg / kg体重的单宁酸会导致肝脏中的多核糖体大量分解，并抑制氨基酸掺入肝蛋白中（25）。在本研究中，与其他治疗相比，T1和RM组的血清尿素氮含量较低。RM组的白蛋白水平低于FM组，而T1和RM组的血清球蛋白和肝MDA较高。这表明单宁酸减少了从肠道吸收的可用氨基酸，并可能损害肝胰腺健康（58）。

除单宁酸外，菜籽粕中的其他抗营养因子也对蛋白质代谢产生负面影响（59）。据报道，菜籽粕中的植酸和芥子油苷会对蛋白质的消化率，氨基酸的生物利用度以及日粮的蛋白质质量产生不利影响（60）。据报道，难消化的植酸-蛋白质复合物和植酸-矿物质复合物会降低虹鳟鱼的生长和蛋白质消化率（61）。芥子油苷分解产物阻碍甲状腺激素代谢并抑制营养代谢（62）。据报道，鲤鱼分离出的异硫氰酸盐对蛋白质的消化利用具有有害作用，并伴有甲状腺功能紊乱（63）。

此外，氨基酸的不平衡可能是RM组生长不良和肌肉蛋白质含量低的主要原因（64）。必需氨基酸（EAA），尤其是赖氨酸（Lys）和蛋氨酸（Met），通常在油菜籽粉中受到限制（65）。EAA缺乏可能影响吸收，合成，和营养物质的代谢（50，  66）。Enami（67）报道，EAA缺乏对高含RM饮食的鱼的生长有负面影响。

在本研究中，与T0组相比，T1组的Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度降低，而蓝细菌，Actinobacteria，Saccharibacteria和Chloroflexi的相对丰度增加。与FM相比，RM中变形杆菌的相对丰度降低，而Firmicutes升高，这表明单宁和菜籽粕的添加改变了细菌群落。肠道微生物都与营养代谢相关联，并且可提供营养例如氨基酸和肽酶的宿主（例如4，  68，  69）。元基因组学数据表明，微生物介导的蛋白质分解机制发生在鱼肠中，而产酶细菌通常在草鱼中起重要作用（70 – 72）。下列属  链球菌，弧菌属，Cetobacterium，梭菌（Clostridia），希瓦氏菌属，和  奈瑟氏球菌  是公知的在鱼肠道（通常发现的蛋白酶生产菌73 – 76）。在本研究中， 与FM组相比，RM组中肠杆菌，链球菌和  梭状芽胞杆菌的相对丰度  更高，这可能是对RM饮食中不平衡氨基酸分布的补偿作用。但是，盲肠杆菌，希瓦氏菌，链球菌，梭状芽胞杆菌和  奈瑟菌的相对丰度  与T0组相比，T1组降低了，这部分解释了单宁酸对蛋白质消化的负面影响。在这种情况下，单宁酸的杀菌功效可能是重要的原因（77）。 由于加香草科  在脱氮中起着重要作用，因此被广泛用于生活污水处理（78）。在本研究中，  Caldilineaceae  与胰蛋白酶活性呈正相关，部分解释了饮食，消化酶和肠道菌群之间的关系。 芽孢杆菌 是α-Proteobacteria，在自然和人工环境中广泛分布，并用作反硝化细菌。据报道它们降低了蛋白质的吸收（79）。 T1组的芽孢杆菌的相对丰度  高于T0组，并且与胰蛋白酶活性呈负相关。这也表明单宁酸对蛋白质吸收的负面影响。

单宁和菜籽粉对草鱼碳水化合物代谢的影响

碳水化合物是相对便宜和能量水生生物的容易获得的来源，特别是草食性鱼其较高淀粉酶活性，和代谢酶的活性（80，  81）。碳水化合物被吸收后，糖原主要沉积在肌肉和肝脏组织中（82）。在本研究中，T1和RM组的淀粉酶和肝糖原活性均显着高于其他治疗。这些结果可能是因为饮食中的单宁刺激了交感途径和肾上腺素，而肾上腺素则促进了淀粉酶的表达[ 83 ]。有人建议通过形成单宁淀粉酶复合物来对抗单宁不利影响的对策（84，  85）。淀粉酶的活性增加，并且碳水化合物的代谢也受到影响。先前的研究表明，0.05％的饮食中α-淀粉酶可改善草鱼的碳水化合物代谢并减少脂质沉积，因为α-淀粉酶可促进碳水化合物分解为葡萄糖，并且更多的碳水化合物被用作能量，但不会转化为脂质，这与本研究的结果一致（86）。

因此，膳食单宁可能在促进碳水化合物的消化和吸收中起重要作用，而产生淀粉酶的细菌通常与此有关（87）。Chloroflexi是海绵和受污染的海洋沉积物中常见的细菌门，由于其具有降解碳水化合物的能力，因此在处理城市废水中非常受欢迎（88）。几种  丙酸杆菌科  细菌 可以产生维生素B ₁₂和淀粉酶（89）。  据报道，cetobacterium能发酵肽和碳水化合物并产生维生素B ₁₂  （90）。在本研究中，绿叶弯曲菌和丙酸杆菌科的相对丰度  与FM组 相比，T1组中的细菌含量显着高于T0组，并且RM组中的细菌总数相对  增加。

单宁和菜籽粉对草鱼脂质代谢的影响

脂质是鱼类饮食中主要的非蛋白质能量来源。然而，作为一个典型的草食性鱼类，脂肪少可用于草鱼，并在实际文化丰富脂质堆积经常发生（91，  92）。在本研究中，与其他治疗相比，T1和RM组的肌肉脂质沉积和脂肪酶活性降低。在一项对大鼠的研究中，饮食中2.5％的可水解单宁降低了脂肪酶的活性，并且单宁与脂肪酶之间的结合强度高是其主要原因（93）。因此，这表明膳食油菜籽粉可以通过抑制膳食脂质的吸收来减少脂质沉积，而单宁酸可能是主要原因。

一项针对大鼠的研究报告称，肥胖大鼠肠道中的杀菌剂/杀菌剂比例较低。原因是Fimicutes和Bacteroides在肠中的互利共生关系，促进了宿主体内能量的吸收和储存（94）。在本研究中部分地观察到了这种关系，因为在接受半纯化饮食的鱼肠中，拟杆菌/杀菌剂的比率分别为10.69和12.43％，而相应的肌肉脂肪比率分别为10.07和7.81％。

单宁和菜籽粉对草鱼健康的影响

在饮食鱼粉替代研究，氧化应激和免疫反应经常报道（95，  96）。在本研究中，RM和T1组的肝脏MDA和血清球蛋白水平更高，而单宁酸的毒性可能是造成这一现象的部分原因（57）。

肠道细菌的多样性是肠道健康的重要指标（2）。（膳食大豆蛋白对肠道细菌多样性的影响已经在许多研究中调查了6，  97 – 99）。根据康奈尔（100），在中等干扰水平下，多样性得到了最大化；因此，较低的物种多样性反映了更稳定的微生物群落。在本研究中，与其他处理相比，T1和RM组的异源肠细菌群落多样性更高。这表明肠道环境受到部分干扰，细菌群落发生了改变。然而，高度的多样性是破坏的早期阶段，生物体可能会逐渐适应和恢复（100）。

变形杆菌是水生动物肠道中常见的优势细菌。Reveco等。（98）报告说，当用30％的膳食粉代替SBM时，大西洋鲑鱼会出现肠炎。响应于此变化，远端肠中变形杆菌的相对丰度降低。一项针对人体的研究表明，炎症性肠病患者中细菌和纤毛虫的相对丰度有所降低（101）。在本研究中，当添加1.25％的日粮单宁酸时，细菌，纤毛虫和变形杆菌的相对丰度降低，草鱼的饮食中包含50％的菜籽粉时，细菌和变形杆菌的相对丰度降低。这表明在草鱼饮食中添加50％的菜籽粉可能会损害肠道，而单宁酸可能是原因。

乳酸杆菌，乳球菌，魏氏杆菌，假单胞菌  和许多  芽孢杆菌  属。（例如，  乙。  巨大芽孢，B。  多粘，和  乙。  枯草）已经被检查作为益生菌水产养殖（46，  102 – 104）。乳酸菌增加针对抗原非特异性的防御机制，并能够调节通过与肠上皮屏障交互的先天免疫反应和刺激肠道炎症免疫反应（98，  104）。在本研究中，相对丰度  与T0组相比，T1组的乳球菌，乳杆菌，韦氏菌，假单胞菌和  芽孢杆菌减少，而   FM组，RM组的假单胞菌  和  芽孢杆菌减少。益生菌的丰度较低的可暗示在鱼与饮食T1和RM（饲喂不太健康鱼肠105，  106）。然而，相对丰度  乳酸  和  Latobacillales  在RM增加。这可能是因为植物成分含有较高水平的碳水化合物，乳酸菌优先将其用作生长的基质（107）。尽管它们的相对丰度有所提高，但这两种细菌仍不足以维持草鱼的健康。

结论

该实验研究表明，添加50％的菜籽粕日粮中添加1.25％的单宁并不是造成草鱼生长性能差的主要原因。但是，单宁酸会损害蛋白质的代谢，减少脂质的消化和积累，并促进碳水化合物的消化。此外，单宁和菜籽粉会扰乱肠道环境并改变其细菌组成。

在未来的研究中，将研究更多的生物标记物以解释单宁和菜籽粉对草鱼生长和健康的潜在机制，并且应采用更先进的技术（例如宏基因组学功能分析）来阐明细菌群落，宿主代谢，疾病表型和饮食。

数据可用性声明

可以在NCBI BioProject登录号PRJNA542992中找到为此研究生成的数据集。

道德声明

该动物研究得到上海海洋大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准。

附加信息

序列信息：所有序列数据均已以登录代码PRJNA542992存放在NCBI序列读取档案中。

作者贡献

有六位作者被认为享有作者资格。JY，XH和PC构思了研究并设计了实验。JY，GZ和ZH有助于进行实验。JY和PC进行数据分析并撰写论文。XH和ER修改了手稿。

资金

这项研究得到了上海海洋大学农业部淡水水生遗传资源重点实验室的支持。